Priony w moczu pacjentów z wariantową chorobą Creutzfeldta-Jakoba AD 5

Każdy cykl składał się z 29 minut 20 sekund inkubacji w temperaturze 37 do 40 ° C, a następnie 40-sekundowego impulsu sonikacji ustawionego na moc od 270 do 280 W. Po jednej rundzie 96 cykli PMCA, próbka amplifikowanego materiału rozcieńczono czynnikiem 10 do świeżego homogenatu mózgu myszy transgenicznych i przeprowadzono dodatkową rundę cykli PMCA. Aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego między rundami, przeprowadzono dokładne odkażanie przyrządów i wyposażenia za pomocą 2 N wodorotlenku sodu lub 4 M izotiocyjanianu guanidyny. Proteinaza K Trawienie i analiza Western Blot
Próbki traktowano proteinazą K (100 ug na mililitr) przez godzinę w 37 ° C z wytrząsaniem. Reakcję zatrzymano przy użyciu buforu do próbek dodecylosiarczanu litu (NuPAGE, Invitrogen), a próbki opracowano metodą Western blot, jak opisano wcześniej.
Wyniki
Wykrywanie PrPSc w moczu metodą Western Blotting i PMCA
Figura 2. Figura 2. Wykrywanie PrPSc w moczu za pomocą PMCA. Jak pokazano w Panelu A, w celu optymalizacji wykrywania PrPSc za pomocą PMCA, ml moczu od osób zdrowych uzupełniono próbkami wariantu homogenatu mózgu choroby Creutzfeldta-Jakoba w różnych rozcieńczeniach (10-5 do 10-12). Po obróbce za pomocą wirowania z dużą prędkością próbki poddawano różnym cyklom 96 PMCA w obecności 10% homogenatu mózgu od transgenicznych myszy eksprymujących ludzkie białko prionowe, które stosowano jako substrat dla PMCA. Sygnał PrPSc oceniano za pomocą analizy Western blot po trawieniu proteinazą K. NBH odnosi się do normalnego (zdrowego) homogenatu mózgu. Jak pokazano w Tablicy B, próbki moczu otrzymane od pacjentów ze sporadyczną chorobą Creutzfeldta-Jakoba MM1 (homozygota metioniny, białko prionu typu 1) (ścieżki 1, 2 i 4), odmiana Creutzfeldta-Jakoba (ścieżka 3) i zdrowe kontrole (ścieżki 5, 6 i 7) zostały przetworzone. Frakcje odpowiadające szczątkom i supernatant zebrano dla każdej próbki i poddano seryjnym rundom 96 cykli PMCA. Jako kontrolę pozytywną, próbki moczu pobrane od osoby zdrowej (ścieżka 9) uzupełniono rozcieńczeniem 10-5 wariantu homogenatu mózgu choroby Creutzfeldta-Jakoba. Ścieżka 8 pokazuje marker masy cząsteczkowej, a ścieżka 10 pokazuje normalny homogenat mózgu, który nie był traktowany proteinazą K (stosowaną jako marker migracji elektroforetycznej). Wynik z próbką moczu od jednego pacjenta z wariantem choroby Creutzfeldta-Jakoba był reprezentatywny dla 13 próbek z pozytywnymi wynikami testu. Jak pokazano w Tablicy C, próbki moczu otrzymane od pacjentów, którzy mieli inne zaburzenia neurodegeneracyjne, w tym chorobę Alzheimera (ścieżka 1), otępienie czołowo-skroniowe (ścieżki 2 i 4), chorobę Parkinsona (ścieżka 3) i postępujące porażenie nadjądrowe (ścieżka 5) zostały poddanych siedmiu seryjnym rundom PMCA
[więcej w: kosmetyki organiczne, hologramy els, castingi dla dzieci ]

Powiązane tematy z artykułem: castingi dla dzieci hologramy els kosmetyki organiczne