Priony w moczu pacjentów z wariantową chorobą Creutzfeldta-Jakoba AD 4

Próbki poddano trawieniu proteinazą K i analizie Western blot, jak opisano poniżej. Rycina 1. Rycina 1. Procedura przetwarzania cyklicznego amplifikacji cyklicznej amplifikacji białek (PMCA) w moczu. Jeden mililitr moczu najpierw odwirowano przy niskiej prędkości w celu oddzielenia odłamków. Frakcję peletek zawierającą szczątki komórkowe ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w ml wody i poddano wirowaniu z dużą prędkością (100 000 x g) w celu wytrącenia nieprawidłowo sfałdowanego białka prionowego (PrPSc). Osad ponownie zawieszono bezpośrednio w homogenacie mózgu od transgenicznych myszy eksprymujących ludzkie białko prionowe i stosowano jako substrat dla PMCA. Frakcję supernatantu z wirowania o niskiej prędkości wirowano z dużą szybkością do osadu PrPSc i usuwano związki moczu, które zakłócają PMCA. Osad ponownie zawieszono w homogenacie mózgu myszy transgenicznych i zastosowano do amplifikacji PMCA. Procedura PMCA obejmuje cykle amplifikacji, w których po inkubacji oligomerycznych zarodków z monomerycznym białkiem prionowym w celu umożliwienia wzrostu polimerów następuje fragmentacja agregatów za pomocą sonikacji w celu zwielokrotnienia liczby jąder do replikacji prionów. Po 96 cyklach PMCA, substrat komórkowy białko prionowe (PrPC) odświeża się, a próbki poddaje się nowej rundzie cykli PMCA.
W przypadku PMCA, próbki moczu były przetwarzane, jak pokazano na Figurze 1. Krótko, ml każdej próbki poddano wstępnemu wirowaniu z małą prędkością (5000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 ° C) w celu wytrącenia szczątków. Supernatant i frakcje peletek zastosowano do detekcji PrPSc po zatężeniu za pomocą odwirowania, jak opisano na Figurze 1. W badaniach z 10 ml próbek moczu przeprowadzono uproszczoną procedurę, w której próbki poddano pojedynczemu wirowaniu przy 100 000 × g przez godzinę w temperaturze 4 ° C. W ten sposób materiały związane zarówno z odpadami jak i supernatantem zostały włączone do próbki. Osad ponownie zawieszono bezpośrednio w 100 .l substratu PMCA.
Procedura PMCA
PMCA przeprowadzono tak, jak opisano uprzednio. 22 Jako substrat wykorzystano próbki mózgu uzyskane od transgenicznych myszy eksprymujących ludzkie białko prionowe z homozygotycznością metioniny przy kodonie PRNP 129. Mózgi zebrano po perfuzji, a 10% homogenat wytworzono w buforze konwersyjnym (fosforanowym). buforowana sól fizjologiczna zawierająca 150 mM chlorek sodu i 1% Triton X-100) z dodatkiem inhibitorów proteazy. W celu zwiększenia wydajności PMCA do homogenatu mózgu dodano 6 mM EDTA i 0,05% digitoniny.
Próbki moczu, przetworzone jak opisano powyżej, mieszano z 10% homogenatem mózgu (z transgenicznych myszy eksprymujących ludzkie białko prionowe) w probówkach zawierających trzy kulki politetrafluoroetylenu (teflon) i poddawano 96 cyklom PMCA za pomocą mikrosonika (model Q700, Qsonica)
[patrz też: zagęszczanie rzęs, frezy do paznokci, agencja interaktywna poznań ]

Powiązane tematy z artykułem: agencja interaktywna poznań frezy do paznokci zagęszczanie rzęs