Połączony niedobór odporności związany z mutacjami DOCK8 ad

Komórki B unieśmiertelniono za pomocą wirusa Epsteina-Barr, a komórki T za pomocą herpeswirusa saimiri (HVS), zgodnie ze standardowymi protokołami. Porównawcze analizy hybrydyzacji genomowej
Porównawcze analizy hybrydyzacji genomowej przeprowadzono z użyciem macierzy 244K przy użyciu platformy Agilent, zgodnie z instrukcjami producenta. Modyfikacje procesu opisano w Dodatku Uzupełniającym.
Sekwencjonowanie DNA
Sekwencjonowanie genomowego DNA przeprowadzono po amplifikacji eksonów za pomocą reakcji łańcuchowej (PCR) z ich flankującymi regionami intronowymi lub nieulegającymi translacji. (Sekwencje starterów są wymienione w Tabeli w dodatkowym dodatku.) Mutacje punktowe zostały potwierdzone w drugiej reakcji amplifikacji PCR, a mutacje przesunięcia ramki odczytu zostały potwierdzone po klonowaniu. Nowatorskie warianty, które zidentyfikowano u 11 pacjentów z indeksami, poszukiwano u 6 pacjentów z autosomalnym dominującym zespołem hiper-immunoglobuliny E (HIES), u 32 pacjentów z innymi chorobami immunologicznymi, u 15 zdrowych dawców krwi o różnym pochodzeniu etnicznym oraz u 100 zdrowych białych osób z grupy kontrolnej. .
Immunoblot
Lizaty cytozolowe przygotowano zgodnie ze standardowymi metodami, a następnie rozdzielono na 3 do 8% żeli z octanu TRIS (Invitrogen) i przeniesiono na nitrocelulozę. Białka wykrywano za pomocą poliklonalnych króliczych przeciwciał anty-DOCK8 (Sigma-Aldrich lub podarowanych przez Dr. Ruusala, Ludwig Cancer Institute, Uppsala, Szwecja16) lub mysich przeciwciał anty-.-aktyny (Sigma-Aldrich) na tej samej blotce. (Aby uzyskać szczegółowe informacje, patrz sekcja Metody w dodatkowym dodatku.)
Cytometrii przepływowej
Zastosowano standardowe metody cytometrii przepływowej do barwienia markerów powierzchni komórkowej i oznaczeń rozcieńczeń estru karboksylu-fluoresceiny z estrem sukcynimidylowym (CFSE). Komórki zebrano do analizy CFSE po 3 dniach hodowli w warunkach stymulacji lub bez stymulacji przeciwciałami anty-CD3 plus anty-CD28. (Dodatkowe informacje można znaleźć w Dodatkowym dodatku).
Wyniki
Wyniki kliniczne
Rysunek 1. Rycina 1. Charakterystyczne wyniki dermatologiczne. Wśród charakterystycznych objawów dermatologicznych u pacjentów biorących udział w badaniu były atopowe zapalenie skóry z rozproszonymi nakładającymi się mięczakami zmianami zakaźnymi na wewnętrznej stronie ramienia (panel A), przewlekłe owrzodzenie anogenitalnego wirusa opryszczki pospolitej (panel B), brodawki okołoporodowe i acralne (panel C ) i mięczak zakaźny z tyłu (panel D).
Pacjenci i ich krewni zostali włączeni w protokoły badań, które zostały zatwierdzone przez instytucyjną komisję przeglądową Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych. Wszystkie osoby badane wyraziły pisemną świadomą zgodę. Kliniczne cechy Pacjenta w Rodzinie 3, Pacjentów i 2 w Rodzinie 4 oraz Pacjentów i 2 w Rodzinie 8 zostały opisane wcześniej. 5, 5, 18 Początkowo badaliśmy trzech pacjentów (pacjentów z Index z rodzin 1, 2 i 3) od grupy pacjentów z niezdefiniowanymi połączonymi niedoborami odporności. Po stwierdzeniu, że te trzy niosą mutację w tym samym genie (DOCK8), stwierdziliśmy, że ich zaburzenia mają pewne cechy kliniczne z nietypowymi postaciami HIES. Dlatego też odszukaliśmy dodatkowych pacjentów i uwzględniliśmy w naszym badaniu kilku pacjentów, którzy zostali wcześniej opisani, łącznie 11 pacjentów w wieku od 6 do 21 lat z ośmiu rodzin5,18 (Tabela 2 w dodatkowym dodatku)
[patrz też: castingi dla dzieci, akcesoria fryzjerskie, agencje hostess ]

Powiązane tematy z artykułem: agencje hostess akcesoria fryzjerskie castingi dla dzieci