Nieswoiste zapalenie jelit i mutacje wpływające na receptor interleukiny-10 ad 6

Panel I przedstawia analizę Western blot fosforylacji STAT3 na tyrozynie 705 w komórkach HeLa stymulowanych interleukiną-10, które były transdukowane retrowirusowo IL10R2 typu dzikiego razem z IL10R1 typu dzikiego lub IL10R1 ze zmutowanym G141R. Dehydrogenaza aldehydu glicerynowo-3-fosforanowego (GAPDH) została użyta jako kontrola do doświadczeń w panelach C, D, H i I. Przeanalizowaliśmy działanie funkcjonalne implikowanych mutacji. Analiza sortowania komórek aktywowana fluorescencją (FACS) ujawniła brak ekspresji IL10R2 w komórkach B transformowanych Eppen-Barr (EBV) uzyskanych od Pacjenta II-3 w Rodzinie A, który nosił homozygotyczną mutację W159X w IL10RB, w przeciwieństwie do silnego IL10R2. ekspresja w komórkach od osobnika niezmienionego (Figura 3A) .31 Figura 3B pokazuje lokalizację mutacji W159X w białku IL10R2.
Kiedy interleukina-10 wiąże się z jej receptorem, sygnalizuje głównie poprzez STAT3 pośredniczenie w jej działaniu przeciwzapalnym. 25. Aby zbadać integralność tego szlaku, stymulowaliśmy komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) lub transformowane EBV komórki B od Pacjenta II -3 w rodzinie A i tych od osobnika z nietkniętymi wpływami z interleukiną-10 i ocenili je pod kątem fosforylacji STAT3 na tyrozynie 705, stosując analizę Western blot. Interleukina-10 indukowała fosforylację STAT3 na tyrozynie 705 w IL10R2 typu dzikiego, ale nie w komórkach z mutacją W159X (figura 3C i fig. 1C w dodatkowym dodatku). W celu odtworzenia funkcji IL10R, która ma zarówno podjednostki IL10R1 i IL10R2, analizowaliśmy komórki B transformowane EBV od Pacjenta II-3 w Rodzinie A, które były transdukowane albo lentiwirusowym wektorem kodującym IL10R2 wraz z białkiem zielonej fluorescencji (GFP) jako gen markerowy lub wektor kontrolny kodujący tylko GFP (Fig. 1D w dodatkowym dodatku). W przeciwieństwie do komórek ujemnych względem IL10R2, rekonstytuowane komórki IL10R2 wykazywały nienaruszoną fosforylację STAT3 na tyrozynie 705 (Figura 3D i Fig. 1E w Dodatku Uzupełniającym). Doszliśmy do wniosku, że mutacja W159X znosi fosforylację STAT3, w której pośredniczy interleukina-10.
Mutacje obserwowane w IL10RA były wariantami missense; analizy za pomocą FACS i analizy Western blot wykazały, że mutacja G141R w białku IL10R1 była eksprymowana na poziomach podobnych do tych w komórkach kontrolnych (Figura 3E i Fig. 2G w Dodatku Uzupełniającym). Kiedy interleukina-10 wiąże się z powierzchnią komórki, najpierw wchodzi w interakcję z IL10R1, a następnie wiąże się z IL10R2. Zastosowaliśmy strukturę pośredniego stanu interleukiny-10-IL10R1 (identyfikator 1Y6K w banku danych białek) w celu modelowania możliwych skutków zmian sensu, 33 przy użyciu algorytmów komputerowych34, 35 (szczegółowe informacje znajdują się w Dodatku Uzupełniającym). Doszliśmy do wniosku, że mutacja IL10R1 G141R, która była zlokalizowana w regionie wiążącym się z interleukiną-10,36, prawdopodobnie ma istotny wpływ na strukturę kompleksu interleukiny-10-receptora (Figura 3F i 3G). Wariant IL10R1 T84I był podobnie przewidywany jako szkodliwy na podstawie modelowania komputerowego i dlatego, że treonina 84 jest wysoce konserwatywna w białkach homologicznych (Fig. 2H i 2I w Dodatku Uzupełniającym).
Aby ocenić funkcjonalną pojemność receptora interleukiny-10, pobudziliśmy PBMC z Pacjenta II-5 w Rodzinie B i od osobnika niezmienionego z rekombinowaną ludzką interleukiną-10, a następnie zmierzyliśmy stopień fosforylacji STAT3 na tyrozynie 705 i serynie 727
[hasła pokrewne: cena badania fsh, dentysta na warszawskiej gdańsk, laser biostymulujący ]

Powiązane tematy z artykułem: cena badania fsh dentysta na warszawskiej gdańsk laser biostymulujący